发布日期：2024-10-08 12:21 点击次数：194
毕赤酵母最早是由赫尔曼·法夫(Herman Phaff)于1956年从橡树上分离的一类甲醇养分型酵母，被定名为Pichia pastoris而成为一个种[1]。1995年P. pastoris被再行归入Komagataella属，之后又被细分为Komagataella pastoris和Komagataella phaffii两个种[2-3]。刻下，毕赤酵母形状菌株CBS7435及豪迈应用的买卖化底盘菌株X33和GS115均包摄K. phaffii种，但大部分文件和数据库仍在使用旧名P. pastoris狠狠爱影院，新名K. phaffii的使用尚有待学界进一步倡导和加强。
动作细胞工场，毕赤酵母具有滋长速率快、不易累积酒精、适于大领域高密度发酵、可将甲醇动作独一碳源和具有翻译后修饰才略等一系列优点。联系于其他真核抒发系统，毕赤酵母在坐褥资本上存在权臣上风。2006年毕赤酵母和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)被好意思国食物及药物护士局(Food and Drug Administration， FDA)认定为公认安全(generally recognized as safe， GRAS)菌株，其安全性也得到了豪迈认同[4]。
在迢遥酵母菌种中，毕赤酵母重组卵白坐褥发酵工艺最为老到，细胞干重可达150 g/L，发酵领域可放大至80 000 L[5-6]。据好意思国Research Corporation Technologies公司的统计()，已有5 000余种卵白见效在毕赤酵母中抒发，1 000多个磋议机构在使用毕赤酵母抒发系统，70多个由毕赤酵母抒发的买卖化产物仍是上市。毕赤酵母的坐褥性能已得到豪迈认同[7]。
毕赤酵母动作底盘菌株也常用于坐褥千般代谢产物，包括但不限于乳酸、丙酮酸等[8-9]。在经过代谢工程改进后，还可坐褥其蓝本不易积聚的酒精以及聚酮类、萜类等高价值化合物[10-11]。毕赤酵母可哄骗甲醇、葡萄糖、甘油和羧甲基纤维素等多种碳源，且响应具有专一性，坐褥资本比较传统化学合成步调愈加便宜[10]。
毕赤酵母遗传配景明晰，在NCBI中不错检索到135个菌株的全基因组测序数据。其中，形状菌株CBS7435偏激买卖化变体GS115基因组测序收尾仍是完成拼接并详备扫视(GenBank登录号：GCA_000223565.1、GCA_001746955.1)[12-13]，为毕赤酵母的代谢工程改进提供了详确可靠的参考。在此基础上，CRISPR/Cas9等基因剪辑器用的豪迈应用进一步加速了毕赤酵母代谢工程改进的要领[14]。不外，比较于大肠杆菌(Escherichia coli)和酿酒酵母等形状微生物，毕赤酵母千般调控元件仍有待进一步发掘[15]。
本文最先对毕赤酵母细胞工场现存的改进期间和标的进行了综述，其次先容了毕赤酵母细胞工场的应用领域和上风，并探讨了毕赤酵母细胞工场应用所濒临的挑战和工程化改进的发展标的。
1 毕赤酵母细胞工场工程化改进期间 1.1 基于线性化质粒载体的同源重组在对毕赤酵母进行改进的历程中，最要紧的改最初骤是将外源基因的抒发盒引入酵母。毕赤酵母因缺少高效的质粒复制起始且质粒拷贝数低[16-17]，在早期磋议往过去通过线性化载体同源重组将抒发盒走漏插入基因组，从而完了贪图基因的插入或替换。刻下，较为老到的整合载体有pPIC9K、pPIC3.5K和pAO815等，不错完了单拷贝或多拷贝的基因整合[18-19]。该步调基于同源重组机制(homologous recombination， HR)，因此线性载体滚动效用、线性载体用量和同源重组效用皆会影响阳性滚动子数目。毕赤酵母的同源重组效用和线性载体滚动效用均较低，因此需要收受更高效的滚动步和解较大的线性载体数目(约1−10 μg)。刻下，电穿孔(electroporation)是总共滚动步调中最为方便且效用最高的步调(表 1)。电穿孔之前使用醋酸锂进行预处理可进一步提高滚动效用[22-24]。受不同插入位点和同源臂长度影响，基因插入效用为 < 0.1%−80%不等，常在同源臂较短时不雅察到大皆的假阳性滚动子[24]。
1.2 基于CRISPR/Cas9的基因剪辑CRISPR/Cas9是继归巢核酸酶、锌指核酸酶(zinc finger nucleases， ZFNs)、转录激活-效应器核酸酶(transcription activator-like effector nucleases， TALENs)后的新一代基因剪辑期间，亦然现存基因剪辑期间中效用最高且操作最方便的期间。CRISPR/Cas9期间使基因剪辑领域发生了编削性的变化。
CRISPR/Cas9在酵母中的功能抒发需要2个要紧元件：Cas9卵白和sgRNA[25]。刻下最常见的Cas9卵白是着手于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的SpCas9，具有2个核酸酶结构域(HNH和RuvC)[26]。因其源于细菌，在进行酵母基因剪辑往过去需要将紧闭位信号同Cas9卵白交融抒发，不然将无法干与核内推崇功能[27]。Cas9需要crRNA和tracrRNA与之统一才略起到靶向切割的作用，在执行应用中，常将二者组合成一条sgRNA[26]。Cas9卵白在与sgRNA统一后构象发生改变不错靶向识别原型终止区相邻基序(protospacer adjacent motif， PAM)相邻的靶序列并产生DNA双链断裂(double-stranded break in DNA， DSB)，激活同源重组或非同源结尾聚会(non-homologous end joining， NHEJ)两种DNA毁伤开导道路从而完了基因剪辑(图 1)。需要防御的是，被CRISPR/Cas9打靶后，毕赤酵母中DSB开导机制可能与酿酒酵母有所不同，具有较高的NHEJ开导效用[26]。刻下，CRISPR/Cas9系统仍是成为一种极其有用的改进器用，已有多套毕赤酵母基因剪辑系统不错完了单基因或多基因剪辑[26-30]。
磋议标明，密码子偏好性会影响Cas9在不同宿主细胞中的抒发后果。比较东说念主源优化Cas9 (HsCas9)、毕赤酵母优化Cas9 (PpCas9)和野生型Cas9 (SpCas9)这3种Cas9在毕赤酵母中的剪辑效用，发现使用HsCas9对GUT1基因的靶向效用高于80%，而使用PpCas9的靶向效用低于5%。野生型SpCas9在毕赤酵母中果真不推崇作用[26]。刻下，酿成HsCas9和PpCas9效用各异的原因尚不解确，推测其效用的各异可能着手于过度优化导致的卵白折叠非常。
Cas9的靶向识别功能依赖于PAM序列。SpCas9的PAM序列NGG在每8−16 bp就地序列中仅存在一个，极地面轨则了剪辑位点的收受[31]。庆幸的是，不同着手的Cas9卵白不错识别不同的PAM序列，对SpCas9进行突变后得到的新变体亦可识别不同的PAM序列。刻下，StCas9、NmCas9、GeoCas9、SaCas9、CjCas9和xCas9等一系列不错识别不同PAM序列的Cas9卵白已见效应用于基因剪辑，有望在改日成为毕赤酵母基因剪辑的有用器用[32-37]。
dCas9是Cas9卵白的突变体，突变位点为D10A/H840A[38]。dCas9统一sgRNA后仅有靶向识别活性，无核酸酶活性，因此无法引起DSB。由此发展出了CRISPR扼制(CRISPR inhibition， CRISPRi)和CRISPR激活(CRISPR activation， CRISPRa)两种期间，刻下已豪迈地应用于基因的扼制与激活(图 2)。CRISPRi不错通过两种形势完了对靶标基因的扼制。一是不错通过统一运行子来打扰RNA团聚酶的拼装和蔓延，效用较差。二是不错通过交融抒发转录扼制结构域(transcription repression domain， TRD)增强扼制后果。CRISPRa旨趣与CRISPRi相通，通过交融抒发转录激活扣构域(transcriptional activation domain， TAD)增强基因抒发。刻下，毕赤酵母的CRISPRi和CRISPRa主要基于对PAOX1进行影响[39-41]。磋议标明，dCas9交融抒发Mxr1和Nrg1不错对求教基因抒发水平进行调控，Nrg1组的求教基因抒发量裁汰至对照组的50%，Mxr1组的求教基因抒发量普及至对照组的4−6倍[40]。基于访佛的旨趣，磋议者开发出了高强度可编程的毕赤酵母平台SynPic-X，完了了卵白的高水平抒发和抒发量的精确调控，具有要紧的应用价值[41]。
1.3 基于CRISPR/Cas12a的基因剪辑Cas12a (Cpf1)是一种Ⅴ-A型Cas卵白，具有访佛于Cas9的核酸酶活性。Cas12a领有访佛于Cas9卵白的RuvC结构域以及相对稀奇的NUC结构域，产生DSB时形成的缺口具有5′悬臂[42]。
刻下，常见的Cas12a卵白有LbCas12a、AsCas12a和FnCas12a[43-45]。与Cas9靶向CG含量高的区域不同狠狠爱影院，Cas12a已被讲解注解不错有用地靶向AT含量高的区域。LbCas12a和AsCas12a的PAM序列为TTTN，FnCas12a的PAM序列为TTN。同期，Cas12a通常不错对多种次优PAM序列起到识别作用，但切割活性会有所裁汰[46]。这些脾气极大蔓延了CRISPR-Cas系统的剪辑位点。
CRISPR/Cas12a仍是成为了毕赤酵母改进的有用器用之一。在对子系元件进行优化后，可在毕赤酵母中完了基于FnCas12a的多基因快速导入和大片断DNA删除[47]。该系统的单基因剪辑效用达99%±0.8%，双基因剪辑效用达65%±2.5%至80%±3%，三基因剪辑效用达30%±2.5%，可动作CRISPR/Cas9系统的有用补充。
综上，毕赤酵母改进期间比年来得到了长足的发展，在剪辑效用和通量方面皆完了了冲突性的普及，为毕赤酵母的复杂多基因剪辑改进提供了强有劲的期间援助。
2 毕赤酵母细胞工场的应用 2.1 基于毕赤酵母的重组卵白坐褥重组卵白是生物成品的中枢产物之一。比年来，重组卵白在疾病防患、疾病支援、工业坐褥等领域中推崇的作用越来越大，鞭策了联系期间的快速发展。刻下，常见的卵白坐褥系统主要有4类，分裂为大肠杆菌抒发系统、酵母抒发系统、虫豸细胞杆状病毒抒发系统(baculovirus expression vector system， BEVS)和哺乳动物细胞抒发系统(表 2)[48-52]。其中，酵母抒发系统的典型代表是毕赤酵母系统。动作最浅近的真核抒发系统，相较于原核抒发系统，毕赤酵母系统无内毒素且在坐褥卵白时具有愈加丰富的翻译后修饰机制[53]。比较于虫豸细胞和哺乳动物细胞抒发系统，其抒发速率更快，坐褥资本更低[54-55]。刻下，磋议者已在毕赤酵母中完了了多种抗原、工业酶等卵白成品的高效坐褥(表 3，表 4)[56-87]。
分泌抒发重组卵白可简化后续分离纯化工艺。毕赤酵母因其具有编码Kex2p、Ste13p等的卵白酶的基因，可对α信号肽进行加工以完了分泌抒发且分泌后果优于其他常见酵母[88]。多种哺乳动物的分泌信号在毕赤酵母中不错平淡推崇功能，进一步丰富了分泌抒发的收受[89-90]。细胞内源分泌的卵白通常会影响观念卵白的分离纯化。毕赤酵母内源分泌卵白数目较少，大大裁汰了分泌型重组卵白的纯化难度和资本[91]。
膜卵白承担着要紧的生物学功能，因此通常需要大皆抒发以用于磋议。膜卵白频繁需要进行特定的共翻译和翻译后修饰才略具有正确的结构和功能。刻下，毕赤酵母已见效抒发NRT1.1、PiPT和P糖卵白等数十种膜卵白[92-95]。因其坐褥资本低、抒发量高且具有多种翻译后修饰道路，有望在膜卵白磋议领域替代CHO系统和BEVS系统[93]。
磋议者已哄骗毕赤酵母抒发系统见效完了了多种重组卵白的坐褥，但仍存在诸多问题。其首要问题是毕赤酵母的N-聚会糖基化(N-linked glycosylation)存在高甘雨糖化且O-聚会糖基化(O-linked glycosylation)较为浅近，这可能改变重组卵白的构象并影响其生物活性[96-97]。有磋议标明，毕赤酵母抒发的抗凝血酶Ⅲ的活性受高甘雨糖化影响被扼制50%[98]。其次，毕赤酵母液泡承担着访佛于溶酶体的功能，含有大皆不同种类的卵白酶，易导致卵白降解从而裁汰卵白产量[49]。另外，在使用甲醇熏陶时，毕赤酵母对甲醇的浓度和甘油、葡萄糖等碳源杂质较为明锐，需要进行熏陶要求的优化[99]。毕赤酵母还存在滚动效用低、可用筛选标识较少等和其他真核系统相通的问题[100]。
2.2 基于毕赤酵母的代谢产物坐褥相较大肠杆菌和酿酒酵母等形状生物，磋议者对毕赤酵母的代谢道路的了解较为浅薄。毕赤酵母动作甲醇养分型酵母，未必氧化甲醇并以其动作合成其他产物的独一碳源。此外，葡萄糖和甘油亦可用作发酵碳源。动作典型的Crabtree-negative酵母，毕赤酵母给与葡萄糖的速率较慢(约为酿酒酵母的1/8−1/9)[101]。在十足好氧的要求下，毕赤酵母不会产生和积聚酒精。加之毕赤酵母pH值安妥范围广(约3.0−7.0)，较为妥贴大领域高密度发酵坐褥千般代谢产物[102]。
2009年毕赤酵母完周到基因组测序，随后磋议者对多个圭臬株进行了详备的扫视，开启了毕赤酵母基因组学和合成生物学磋议的大门。毕赤酵母进行代谢工程改进或发酵要求优化后，可完了多种代谢产物的坐褥，包括但不限于乳酸、丙酮酸、酒精、聚酮类和萜类等(表 5)[103-114]。刻下，受限于过期的改进妙技，大部分针对毕赤酵母的代谢工程改进较为浅近。
综上，毕赤酵母细胞工场仍是成为一种高效的生物合成平台并豪迈应用于各个领域。跟着合成生物学磋议的真切，毕赤酵母细胞工场应用范围有望进一步拓展，一些现存的不及也有望通过定向改进得以克服。
3 毕赤酵母细胞工场工程化改进标的为了克服毕赤酵母动作细胞工场的诸多劣势，磋议者对其进行了大皆的工程化遗传改进，以期得到性能优良的毕赤酵母底盘菌株(图 3)。
3.1 普及同源重组效用在DNA双链断裂开导机制上，毕赤酵母和酿酒酵母存在一定各异，主要为NHEJ而非HR。NHEJ开导速率快但就地性强，HR开导历程较为复杂但愈加精确(图 4)。NHEJ开导占上风时会影响HR开导并加大筛选责任量[115]。如需进行精确高效的基因剪辑责任，有必要将毕赤酵母改进为高HR效用的底盘菌株。刻下，磋议者仍是探索出多种改进决议，举例敲除NHEJ要道基因Ku70、过抒发促进HR的Rad52等基因、敲除HR扼制基因Mph1等[115-117]。
磋议标明，使用Ku70劣势菌株在同源臂长仅250 bp的要求下可对His4和ADE1位点完了90%以上的剪辑效用[115]。与之追随的是，敲除Ku70基因后菌株抗紫外线的才略低于野生型菌株。在使用Ku70劣势菌株敲除GUT1基因时未检测到NHEJ且相较野生型菌株滚动率大大裁汰，因此以为敲除Ku70基因不错十足失活NHEJ联系道路，进一步解释了失活Ku70基因普及剪辑效用的旨趣[27]。刻下，使用Ku70劣势株进行毕赤酵母基因剪辑仍是成为了毕赤酵母改进的常用步调[116， 118-120]。
HR联系基因的抒发水平与同源重组效用巢倾卵破，过抒发Rad52等HR联系基因可权臣增强重组的走漏性。在对多种HR联系基因进行磋议时发现，高抒发Rad52可将单基因剪辑效用普及至90%，敲除Mph1基因可使多片断重组效用普及13.5倍[116]。在Cas9卵白C端交融抒发Mre11且过抒发Rad52的情况下，双基因和三基因剪辑效用均得到权臣普及，达到了86.7%和16.7%[121]。基于上述磋议收尾，磋议者通过过抒发RAD52、RAD59、MRE11和SAE2基因进一步提高HR效用，使用含40 bp短同源臂的供体即可完了100%的单基因剪辑效用和81%的三基因剪辑效用，得到了可进行高效改进的底盘菌株[117]。
3.2 挖掘和开发遗传元件毕赤酵母动作非形状酵母，其遗传元件(genetic element)的挖掘和开发相对滞后。与大肠杆菌、酿酒酵母等形状生物比较缺少千般的运行子和筛选标识[122-123]。自然仍是开发出诸如GoldenPiCS等毕赤酵母抒发和改进器用包，极地面方便了对毕赤酵母的改进[124-125]，但可用运行子仍局限于PGAP、PADH2、PAOX1和PTEF1等约20种运行子，筛选标识仅局限于ADE2、HIS4、Trp2等为数未几的养分劣势型基因和BleoR、KanMX、hphMX和nrsR等抗性基因，熏陶形势也唯独甲醇熏陶、甘油熏陶和葡萄糖熏陶[122， 124-125]。这些遗传元件在进行复杂的多基因剪辑改进代谢道路时显得衣衫不整，需进一步发掘和开发新的遗传元件和器用包。
3.3 改进卵白糖基化修饰糖卵白的糖基分为N-聚会糖基和O-聚会糖基两种类型。N-聚会糖基聚会在Asn-X-Thr/Ser保守序列中的天冬酰胺(Asn)上(其中的X为除脯氨酸之外的淘气氨基酸残基)[126]。O-聚会糖基的结构比N-聚会糖基愈加浅近且聚会位点更多，常出当今丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)上[126]。抗体、酶等大部分有生物活性的重组卵白产物需要进行安妥的糖基化修饰。磋议标明，糖基化(十分是N-聚会糖基化)关于卵白的构象、半衰期和免疫原性等多个方面具有要紧影响[127]。毕赤酵母动作最浅近的真核抒发系统，未必进行高甘雨糖化修饰，但会影响卵白结构并提高其免疫原性，可能裁汰毕赤酵母坐褥的重组卵白的活性和半衰期[128]。因此，对毕赤酵母糖基化修饰进行改进(十分是东说念主源化改进)对提高毕赤酵母细胞工场坐褥才略具有重正途理。
针对毕赤酵母的糖基化修饰改进最早通舛讹活Och1基因并导入UDP-GlcNAc转运体和α-1，2-甘雨糖苷酶基因得到了具有GlcNAc-Man5-GlcNAc2糖基化修饰的菌株[129]。在此基础上，进一步导入N-乙酰氨基葡萄糖转变酶I和β-1，4-半乳糖转变酶等基因可愈加走漏地惩办高甘雨糖化问题[130]。失活Och1和Alg3基因并导入Mns I、GnTI、GnTⅡ和GalTI基因不错将毕赤酵母糖基化修饰改进为GlcNAc2-Man3-GlcNAc2，这向糖基东说念主源化迈出了要紧的一步。Hamilton等通过复杂的改进，完了了毕赤酵母糖基的东说念主源化并使用毕赤酵母坐褥了具有东说念主源化糖基修饰的免疫球卵白G (IgG)[131-132]。
3.4 裁汰卵白酶活性毕赤酵母在坐褥卵白的历程中会因受到恐吓产生卵白酶，导致观念卵白产率下落、分离纯化贫瘠和卵白活性裁汰[133]。在毕赤酵母中，液泡是外源卵白降解最主要的状态，约80%的卵白质会在酵母液泡中被降解，还有一部分在细胞基质被降解[134-135]。刻下，工业坐褥中常用的惩办办法有3种[136]：(1) 在培养基中添加过量的卵白酶水解底物；(2) 添加对应的卵白酶扼制剂；(3) 优化发酵要求，十分是优化温度和pH值。可是这些步调皆不可从根柢上惩办卵白酶水解的问题，况且还会给卑劣分离纯化加多贫瘠。根柢惩办卵白降解问题需要对毕赤酵母进行基因工程改进。
自拍视频刻下不错笃定PEP4和Prb1两个基因在水解外源卵白中推崇要紧作用。PEP4基因编码卵白酶A (proteinase A)前体。卵白酶A前体在内质网进行糖基化并在高尔基体中进行切割后转运至液泡[137]。卵白酶A不错催化卵白质水解并与卵白酶B、羧肽酶Y、氨肽酶Ⅰ等多种酶的激活联系，因此，PEP4基因是液泡卵白酶系统的要道基因，敲除PEP4基因可惩办多数卵白降解问题。Prb1编码卵白酶B，在被卵白酶A激活后具有卵白酶活性[99]。卵白酶B的酶原在一定的要求下也具有卵白酶活性，因此在惩办卵白降解问题的历程中敲除Prb1基因具有较正途理。刻下已有多种见效的买卖化卵白酶劣势菌株，举例SMD1163 (PEP4-Prb1-His4-)、SMD1168 (PEP4-His4-)、PichiaPink 2 (ADE2-PEP4-)、PichiaPink3 (ADE2-Prb1-)和PichiaPink4 (ADE2-Prb1-PEP4-)等。此外，对YPS1-3、YPS7和MKC7等编码卵白酶的基因进行改进也具有减少卵白降解的后果[138]。
3.5 改进代谢通路坐褥小分子代谢产物是毕赤酵母动作细胞工场的要紧职责之一。随撰述为代谢工场上风的逐渐披露和多基因一步剪辑期间的发展，通过合成生物学和代谢工程的步调挖掘毕赤酵母坐褥后劲已成为热门领域。刻下，对毕赤酵母代谢通路的改进有两大想路：引入异源酶优化自然代谢产物的合成和举座敲入多个异源基因导入新的代谢通路。
对S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine， SAM)合成道路的代谢工程改进是引入异源酶优化自然代谢产物的经典案例。该磋议通过过抒发SAM2基因使SAM产量提高45倍[139]。与之访佛，通过抒发异源D-阿拉伯糖醇和木糖醇脱氢酶未必使木糖醇的产量普及至0.29 g/(L·h)[140]。磋议者通过pGAPZB质粒导入3个外源基因，使本身无法坐褥番茄红素的X33菌株见效抒发了番茄红素，产量可达73.9 mg/L[126]。但该种步调存在着坐褥性能不走漏和质粒可能丢失的劣势。跟着多基因一步剪辑期间的发展和迢遥中性位点被轻松，多个异源基因走漏整合设置新的代谢通路仍是成为可能[126]。使用多基因一步剪辑期间不错完了番茄红素要道基因的一步快速导入，使酵母菌株可愈加走漏地坐褥番茄红素[127]。跟着多基因一步剪辑期间的冲突，磋议者通过导入数十个外源基因完了了在毕赤酵母中长春质碱的高效合成，比较于同类型的酿酒酵母细胞工场坐褥才略提高了25倍，开启了毕赤酵母代谢通路改进的新纪元[113， 141]。
总而言之，在对毕赤酵母细胞工场进行定向改进后不错惩办其存在的诸多劣势并赋予其新的坐褥功能，从而提高坐褥效用并拓展应用领域。
4 转头与推测经过近50年的施行应用，毕赤酵母的生物合成才略、发酵坐褥资本和生物安全性仍是得到了业界豪迈认同，但动作新期间合成生物学细胞工场，其工程化改进和哄骗仍有待进一步挖掘和探索。
最先，比较于酿酒酵母，毕赤酵母缺少高效用的剪辑妙技和饱胀的合成生物学元件。在基因剪辑妙技方面，毕赤酵母的联系磋议远远过期于酿酒酵母。刻下，在酿酒酵母中已见效应用的StCas9、XCas9、Cas13a、Base editing和Prime editing等新式剪辑器用以及供体适配等新式基因剪辑政策还未拓展至毕赤酵母，有待进一步磋议[31， 142-146]。与此同期，毕赤酵母改进中可使用的遗传元件较少，仍需进一步发掘。比较于酿酒酵母，毕赤酵母同源重组效用低亦然轨则其改进和发展的要要紧素。刻下已有的惩办决议在普及同源重组效用的同期仍存在菌株致死率高和安妥性差等问题。
其次，在进行工业坐褥的历程中，毕赤酵母的抗逆性会在很猛进程上影响资本和产量。毕赤酵母具有较强的pH安妥才略，但耐热性等抗逆性状与同属甲醇养分型酵母的多形汉逊酵母(Ogataea polymorpha)仍有较大差距[147]。因此，对毕赤酵母的抗逆性联系基因进行改进可能有助于进一步裁汰其发酵坐褥资本。
再次，毕赤酵母动作口服寄递平台的磋议仍然较少。现如今，对口服药物或口服疫苗进行寄递时主要收受东说念主造纳米颗粒、大肠杆菌和酿酒酵母等老到的寄递平台。十分是酿酒酵母，因其较强的安全性、老到的名义展示机制以及在细胞壁中具有促进免疫的β-葡聚糖，经浅近改进即可对DNA疫苗或其他功能性分子进行口服寄递[148-149]。毕赤酵母与酿酒酵母同属GRAS菌株，在具备上述优点的同期还具有更好的耐酸碱才略和卵白抒发才略，不错更好地在胃肠液中生活并推崇功能[150-151]。因此，毕赤酵母有望成为存在于东说念主类或动物胃肠说念中的细胞工场。
另外，毕赤酵母动作一种甲醇养分型酵母存在甲醇哄骗率低和对甲醇浓度明锐的问题[152]。在坐褥部分低附加值的化学产物时，甲醇哄骗率将会极地面影响坐褥的经济性。因此，有必要对毕赤酵母的甲醇哄骗联系道路进行进一步的代谢工程优化以获得愈加优良的底盘菌株。
总之狠狠爱影院，毕赤酵母在合成生物学领域具有独到的上风，应用远景开阔但仍具挑战性。治服跟着高通量基因剪辑平台的开发和代谢工程磋议的真切，毕赤酵母细胞工场将成为合成生物学领域不可或缺的变装。
